lunes, 2 de marzo de 2015

Fecundacion in vitro de erizos de mar

ESTUDIO DE LA FECUNDACIÓN DEL ERIZO DE MAR (Paracentrotus lividus) EN CONDICIONES DE LABORATORIO.

Fundamento:

En los organismos con reproducción sexual el óvulo es fecundado por el espermatozoide formándose el cigoto, a partir del cual se originará el nuevo individuo. La contribución de los gametos masculino y femenino al cigoto es muy diferente; el óvulo aporta tanto su conjunto haploide de cromosomas como un rico citoplasma que posee los requerimientos necesarios para que, al menos, se inicie el desarrollo. El espermatozoide, sin embargo, principalmente aporta su núcleo y escasos componentes citoplasmáticos (centriolos).
                                               

Los equinodermos se usan habitualmente en estudios de biología del desarrollo ya que sus gametos se obtienen en grandes cantidades, pueden ser inseminados fácilmente in vitro (en medio acuoso donde la fecundación ocurre de forma natural) y también son sencillos de mantener en el laboratorio. Además, la fecundación en equinodermos y en mamíferos tiene muchos puntos en común. 

Materiales y reactivos:

-          Jeringuillas
-          Solución de KCl 0,5 M.  
-          Oricio o erizo de mar
-          Tubos de ensayo
-          Placas petri
-          Pipeta pasteur
-          Portas y cubres.
-          Vidrios de reloj.

Objetivo de la práctica:

La práctica consistirá en estudiar el proceso de fecundación y primeras etapas del desarrollo embrionario en erizo de mar. Para ello, en primer lugar se obtendrán los gametos, a continuación se procederá a realizar el proceso de fecundación y finalmente se analizarán los procesos de segmentación.

Procedimiento experimental:

Preparamos la disolución 0,5M de KCl, pesando 9.31 g en una báscula de precisión para disolver en un matraz aforado. Se le entrega a cada grupo dos erizos de mar para realizar la práctica. se ponen en una placa petri o similar con la boca hacia arriba

Obtención de gametos:

  1. Con una jeringuilla inyectamos a cada oricio un poco de la disolución de KCl, previamente preparada, a través del peristoma (membrana que rodea la boca)
  2. Se agita gentilmente a los oricios y se dejan reposar sobre la cara aboral, es decir, igual que antes.
  3. Después de unos momentos, se expulsaran por el ano los gametos, ya que tienen en esa zona las gónadas.si el líquido expulsado es blanquecino se tratará de esperma y si es de un color rosáceo, óvulos.
  4. Depositando un poco de dichas sustancias en varios portas, se observaran al microscopio los gametos. En el caso de los espermatozoides, habrá que diluirlos en agua de mar para activarlos.
Los óvulos se conservan en el frigorífico por espacio de unas pocas horas. Los espermatozoides se pueden mantener hasta 24 h en seco y sin diluir en agua. 

Fecundación:

  1. Se rellena un tubo de ensayo con unos tres dedos de agua de mar.
  2. En el se verte, con ayuda de una pipeta pasteur, una cierta cantidad de óvulos y espermatozoides. Tras esto se agita el tubo de ensayo para una mejor mezcla.
  3. Según el tiempo que pase desde la fecundación hasta cuando observemos el proceso, encontraremos diferentes estadios de desarrollo.

  • 5 minuntos: Membrana de fecundación
  • 1 h 1ª División de segmentación
  • 2 h 30 min: Embrión de 16 células
  • 6-12 h Blástula.
  • 24 h Gástrula.
  • 48 h Larva Pluteus

Este proceso, también se puede realizar en un porta objetos, pero los resultado no serán muy exitosos. Tampoco se verá muy claro el momento de la fecundación debido al pequeño tamaño de los espermatozoides respecto a los óvulos.

Observación al microscopio:

Tras unas horas se recogerá un poco de precipitado junto con agua marina para observarlo al microscopio. 

Análisis de los resultados:

Aun no haciéndolo en las mejores condiciones de laboratorio, conseguimos la fecundación de los óvulos de los erizos de mar. Sin embargo, no conseguimos etapas de desarrollo mayores a unas cuantas células. También la tasa de fecundación fue bastante baja, lo que nos hizo pensar que si se mantuviera la misma tasa en el mar, sería muy poca la descendencia que surgiría en comparación con la cantidad de gametos expulsados.

Imágenes:

Óvulo fecundado. Microscopio óptico 250 aumentos.


  Óvulo fecundado. Microscopio óptico 1125 aumentos.
Óvulos. Microscopio óptico 250 aumentos.
Óvulo fecundado. Microscopio óptico 100 aumentos.

Óvulo fecundado. Microscopio óptico 100 aumentos.

Óvulo fecundado. Microscopio óptico 100 aumentos.

Óvulo fecundado. Microscopio óptico 100 aumentos.

Óvulo fecundado. Microscopio óptico 100 aumentos.

Óvulo fecundado. Microscopio óptico 100 aumentos.

Membrana fecundación. Microscopio óptico 400 aumentos.

video
Espermatozoides. Microscopio óptico 1125 aumentos.
Hecho por Diego Sanz, Sergiy Vasatyuk, Pablo Gómez, Pelayo Comino

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